用逆转录的方法获取目的基因,是否一定要知道该基因的核苷酸序列?

不一定要知道目标基因的确切核苷酸序列才能通过逆转录的方法获取该基因。逆转录的关键步骤是:

1. 分离整合了目标基因的mRNA,这需要知道目标基因所在的组织或者细胞,以及目标基因的表达情况,从而选择合适的样本进行mRNA的提取。但不需要知道具体的核苷酸序列。

2. 用反向转录酶和随机引物或 Wings 抑制 priming 来合成第一条DNA链。随机引物可以结合在mRNA的任何位置,所以不需要知道确切的序列。Wings 抑制 priming 也不需要目标序列信息。

3. 然后用RNA酶H降解 mRNA,留下单链cDNA。

4. 合成第二条DNA链,得到双链cDNA。

5. 筛选出包含目标基因的cDNA克隆。这一步可以通过第三方诊断盒染色检测,screening,或循环斑点杂交等方式完成。也不需要知道具体的核苷酸序列。

6. 测序和分析获得的cDNA克隆,最终可以推断出目标基因的完整核苷酸序列及其开放阅读框。

所以,总之,逆转录并不严格要求已知目标基因的确切核苷酸序列。只需要选择正确的样本和方法来分离mRNA,然后逆转录就可以实现基因的克隆。当然,如果事先已经部分知道目标基因的序列信息,那么会更有针对性地设计引物,会提高效率,但这不是必须的。关键是要找到表达目标基因的细胞和正确分离mRNA。

希望上述解释能够解答您的问题。如果还有不清楚的地方,欢迎继续提问。