为什么获取一个目的基因共产生4个游离的磷酸基团？

一个DNA片段在体外扩增(PCR)过程中,为了获得足够的产物用于后续目的,通常需要设计引物和优化反应条件。为获得更多的扩增产物,一个常用手段是修改PCR反应中dNTP的比例,增加dATP和dTTP的浓度,这可以促进A-T富集的产物生成。

增加dATP和dTTP浓度后,它们在PCR反应中的比例相对较高,会被聚合酶优先选择并掺入到扩增产物中。这会导致产物序列中A-Tcomposition增加。而由于碱基配对规则,A只会与T结合,G只会与C结合。所以当A-Tcomposition增加时,G-Ccomposition也同样增加,这会产生过多的G-C碱基对。

在PCR产物末端,这些额外的G-C碱基对会与另一条DNA链的末端碱基对结合,但却无法与引物配对。也就是说,在PCR扩增的最后几个循环中,引物可以与模板DNA完美配对和延伸,但新合成的互补链末端会产生一定数量的游离碱基,其中大部分为G和C。

所以,增加dATP和dTTP浓度可以获得更高的产物浓度,但同时也会产生一个不可避免的副作用:引物无法与新合成DNA链的末端完全互补配对,这会在PCR产物的两端各产生几个游离的G和C碱基,影响产物的稳定性和后续处理。

总的来说,在PCR反应中通过增加dNTP比例来获得更多产物,虽然可以达到提高产量的目的,但也会产生游离的G-C碱基对,这是由于引物无法完全与新合成的互补链末端配对造成的。要 elimination这种副作用,需要在PCR后处理时对产物进行修饰,例如 civilized和回收目的片段以去除末端游离碱基。